Wie wir seit langem wissen, ist die Natur eine hervorragende Inspirationsquelle für viele Studien, Entdeckungen und Experimente. Vögel und geflügelte Insekten haben uns gezeigt, dass der Himmel durchaus erreichbar ist, aquatische Säugetiere haben uns gezeigt, wie wir unseren Aufenthalt unter Wasser verlängern können, und Spinnen haben bewiesen, dass selbst die kleinsten Kreaturen etwas Unglaubliches erschaffen können. In der Studie, die wir heute betrachten, haben Wissenschaftler des Instituts für physikalische und chemische Forschung (Wako, Japan) einen Weg gefunden, mit phototrophen Bakterien ein künstliches Netz zu schaffen. Wie genau haben sie dies erreicht, wie natürlich sind die resultierenden Spinnweben und warum wurden phototrophe Bakterien verwendet? Antworten auf diese und andere Fragen erwarten uns im Bericht von Wissenschaftlern. Gehen.
Forschungsgrundlage
Für viele Menschen sind Spinnen "Oh Gott, hol ihn von mir!" oder "ugh, was für ekelhaft." Wenn man jedoch Phobien und Vorurteile gegen diese Kreaturen beiseite lässt, kann man überlegen, wie einzigartig diese achtbeinigen Raubtiere sind. Die Spinnenanatomie ist buchstäblich für die perfekte Jagd gemacht. Einerseits gibt es ein Gift, das Beute oder den Feind lähmen oder sogar töten kann. Andererseits gibt es gut entwickelte Sinnesorgane (insbesondere Berührungen aufgrund von Trichobothrie (Haaren) im ganzen Körper). Die Visitenkarte der Spinnen, die zur Grundlage vieler Metaphern und Schlagworte geworden ist, ist ihr Netz.
Ein Video darüber, wie Spinnen ihr berühmtes Netz produzieren.
Eine Bahn ist im Kern ein Protein, dessen Zusammensetzung reich an Glycin (C 2 H 5 NO 2 ), Alanin (NH 2 -CH (CH 3 ) -COOH) und Serin (HO 2 C-CH (NH 2 ) CH 2 OH ist ). Ein Spinnennetz wird in einer speziellen Drüse gebildet, wo es in flüssiger Form vorliegt.
Wenn die Sekretion der Drüse durch zahlreiche Spinnrohre ausgeschieden wird, bilden spezielle Spinnenwarzen Fäden daraus, aus denen die Spinne ihre tödlichen Fallen baut.
Spinnennetzfäden sind einzigartig, weil ihre mechanischen Eigenschaften vielen anderen Materialien überlegen sind. Beispielsweise beträgt die Zugfestigkeit eines Spinnennetzes für eine gewöhnliche Spinne ( Araneus diadematus ) 1,1 bis 2,7 GPa, für ein menschliches Haar 0,25 GPa und für Stahl 0,4 bis 1,5 GPa. Die Dichte von Spinnenseide beträgt 1/6 der von Stahl (1,3 g / cm 3 ). Das heißt, wenn Sie mit einem Netz um die Erde gehen, beträgt sein Gewicht nur 500 Gramm. Die Energiedichte beträgt ca. 1,2 × 108 J / m 3... Spinnenseide ist auch extrem flexibel, d.h. kann sich bis zum 5-fachen seiner ursprünglichen Länge (in entspanntem Zustand) ohne Unterbrechungen dehnen. Die Schlagfestigkeit von Spinnennetzen ist vergleichbar mit Polyaramidgarnen. Spinnen sind nicht extremophil, aber ihre Netze können Temperaturen von -40 ° C bis 220 ° C leicht überstehen. Darüber hinaus ist Seide aufgrund ihrer biologisch abbaubaren und biokompatiblen Eigenschaften für medizinische Anwendungen geeignet.
Vergleich der Zugfestigkeit von Stahlfaden und Spinnenseide (entsprechende Dichte).
Es ist auch merkwürdig, dass eine Art von Spinne mehrere Arten von Bahnen produzieren kann, die sich in ihren Eigenschaften und ihrer Verwendung unterscheiden (Spinnen der Argiope argentata-Arten produzieren bis zu 5 Varianten der Bahn):
- für die Außenkanten und den Stegrahmen (sehr langlebig);
- für Bereiche, in denen Beute gefangen wird (sehr klebrig, elastisch und langlebig);
- ( );
- ( 2 3 );
- ;
- .
Dies ist nur eine kurze Beschreibung der Spinnenseide, aber selbst das reicht aus, um die Einzigartigkeit dieser Substanz zu verstehen. Deshalb haben viele Wissenschaftler lange versucht, ein künstliches Äquivalent zum Web zu schaffen. Für viele ist dies recht erfolgreich. Das Problem der Massenproduktion bleibt jedoch ungelöst.
In der Arbeit, über die wir heute nachdenken, haben Wissenschaftler eine Lösung für dieses Problem vorgeschlagen. Es besteht aus der Verwendung des lila Bakteriums Rhodovulum sulfidophilum , das die Eigenschaften von Phototrophen * und Halophilen * aufweist .
Phototrophe * sind Organismen, die Licht zur Energieerzeugung nutzen.
Halophile * sind eine Art von Extremophilen, die unter Bedingungen mit hohem Salzgehalt leben.R. sulfidophilum ist ein marines anoxygenes photosynthetisierendes * Bakterium mit unterschiedlichen Stoffwechseleigenschaften, das Biowasserstoff, Biokunststoffe und extrazelluläre Nukleinsäuren produziert.
Anoxygene Photosynthese * - Im Gegensatz zur herkömmlichen Photosynthese wird bei der anoxygenen Photosynthese kein molekularer Sauerstoff gebildet.Die wichtigste Fähigkeit von R. sulfidophilum für Wissenschaftler ist jedoch seine Fähigkeit, unter photoautotrophen Bedingungen durch die Verwendung kostengünstiger und erneuerbarer Ressourcen wie Licht (Energie), CO 2 (Kohlenstoffquelle) und N 2 (Stickstoffquelle) durch Photosynthese- und Fixierungsprozesse zu wachsen . Stickstoff. Darüber hinaus gedeiht R. sulfidophilum im Meerwasser, was dazu beiträgt, das Risiko einer biologischen Kontamination während des Anbaus zu verringern.
In den letzten Jahren wurden gute Ergebnisse bei der Massenproduktion von Spidroin (MaSp, Spinnenseidenprotein) unter Verwendung rekombinanter Wirtsorganismen ( Escherichia coli- Bakterien , Pichia pastoris- Hefe , Seidenraupe ) erzieltBombyx mori , Tabak, Säugetierzellkulturen usw.).
Die Autoren dieser Arbeit bestreiten nicht den Erfolg ihrer Vorgänger, stellen jedoch aufgrund der hohen Produktionskosten selbst extrem geringe Produktionsmengen und relativ hohe Kosten des Endprodukts fest (bei der mikrobiellen Fermentation sind 70% der Produktionskosten Rohstoffe).
In ihrer Studie schlagen die Autoren eine neue Methode zur wirtschaftlichen und effizienten Herstellung von Spinnenseide unter Verwendung des Bakteriums R. sulfidophilum vor , das in der Lage ist, eine hydrophobe Wiederholungssequenz MaSp1 (Spidroin-1) unter Verwendung einer kleinen Menge organischer Substanz unter Bedingungen eines photoheterotrophen oder photoautotrophen Wachstums herzustellen.
Forschungsergebnisse
Zunächst musste das Bakterium R. sulfidophilum hergestellt werden .
Es wurde bereits früher über die Möglichkeit der Einführung von exogener DNA in das Plasmid berichtet R.sulfidophilum durch bakterielle Konjugation * Plasmide , die von pCF1010 und abgeleitet unter Verwendung von E. coli S17-1 als Donorstamm.
Konjugation * - unidirektionaler Transfer eines Teils des genetischen Materials während des direkten Kontakts zweier Bakterienzellen.In dieser Studie wurde beschlossen, einen anderen Vektor (pBBR1MCS-2) zu verwenden, der ein Kanamycin-Resistenzgen, ein Mob-Gen, das eine spezifische Nuklease codiert, und eine Transferquelle ( oriT * ) enthält, die bei der gramnegativen Bakterienkonjugation weit verbreitet sind.
oriT * ist eine kurze Sequenz (bis zu 500 bp), die für den Transfer von DNA, die sie enthält, von einem bakteriellen Wirt zu einem Empfänger während der bakteriellen Konjugation erforderlich ist.Im Chromosom von R. sulfidophilum (Zugangsnummer NZ_CP015418) waren an den Loci A6W98_RS06280 und A6W98_RS17070 zwei Tellurit-Resistenzgene vorhanden, die für ein Tellurit-Resistenzprotein der TerB-Familie kodieren.
Resistenzmerkmale gegen Kanamycin und Tellurit wurden als Marker für die Selektion positiver Konjuganten von R. sulfidophilum verwendet .
Plasmid * pBBR1-Ptrc-MaSp1 enthielt:
- der * trc- Promotor (Ptrc), der ein potenter konstitutiver Hybridpromotor in E. coli ist;
- die Sequenz "AGGAGA" der Ribosomenbindungsregion (RBS);
- MaSp1 Nephila clavipes, ( ) E.coli (1a, 1b).
* — , .
* — , - ( ).Etwa 0,4 g feuchte Zellmasse (CWM aus Zellfeuchtmasse ) wurde aus 50 ml rekombinantem erhalten R. sulfidophilum Kultur zur stationären Wachstums unter photoheterotrophen Bedingungen wachsen gelassen, und zwar von Meerbrühe (MB aus Meeresbrühe ) mit LED - Beleuchtung bei (730 nm, 20-30 W / m 2 ) für 4 Tage.
Bild Nr. 1
Trotz der Tatsache, dass eine Überexpression der rekombinanten MaSp1-Proteine nicht in allen rekombinanten Kulturen von R. sulfidophilum unter Verwendung von Polyacrylamid-Gelelektrophorese / SDSPAGE ( 1c) eindeutig nachgewiesen wurde) wurde die positive Expression von MaSp1-Proteinen durch Protein-Immunoblotting für alle erzeugten rekombinanten R. sulfidophilum- Zellen bestätigt, die pBBR1-Ptrc-MaSp1- (1-mer, 2-mer, 3-mer oder 6-mer) tragen ( 1d ).
K-Maße * - Teilsequenzen der Länge k, die in einer biologischen Sequenz enthalten sind.Die einzige Wiederholungsdomäne in den resultierenden Konstrukten enthält 33 Aminosäurereste der folgenden Form:
NH 2 -SGRGGLGGQGAGAAAAAGGAGQGGYGGLGSQGT-COOH.
Das theoretische Molekulargewicht von Zielproteinen, einschließlich Nicht-Sidroin-Sequenzen (Spaltregionen von His-Tag, S-Tag, Enterokinase und Thrombin) am N-Terminus beträgt 7,9 kDa für 1-mer (81 aa); 10,5 kDa für 2-mer (114 aa); 13,1 kDa für 3-mer (147 aa) und 20,9 kDa für 6-mer (246 aa).
Ja - Bezeichnung der Atommasseneinheit; kDa - Kilodalton (1 kDa = 103 Da).Zusätzlich zur Bestätigung der Expression von MaSp1-Proteinen wurde auch deren Menge an MaSp1-Proteinen geschätzt, die aus rekombinanten Kulturen von R. sulfidophilum erhalten wurden : ~ 3-10 mg / l (1-mer = 3,4 mg / l; 2-mer = 3,9 mg / l ; 3-mer = 10,2 mg / l; 6-mer = 6,8 mg / l) oder 3,5–6,9% der Gesamtmenge an Proteinen. Zum Vergleich: Die heterologe Expression von Spidroinen im bekannten und weit verbreiteten rekombinanten System von E. coli kann nur ~ 0,3–1,2 mg / l gereinigtes Spidroin produzieren.
Das dominante Allel wird durch einen Großbuchstaben (A gegen a) angezeigt. Da jeder Elternteil ein Allel bereitstellt, sind die folgenden Kombinationen möglich: AA, Aa und aa.
Das überraschendste Ergebnis dieser Studie ist laut Wissenschaftlern die Demonstration von mikrobiellen Zellfabriken auf der Basis mariner photosynthetischer Organismen, in denen ein photoautotropes Wachstumsregime unter Verwendung erneuerbarer Non-Food-Rohstoffe und Meerwasser als Kulturmedium angewendet werden kann.
R. sulfidophilum , das pBBR1-Ptrc-MaSp1- (6-mer) trägt, wurde in künstlichem Meerwasser (Daigo ASW aus künstlichem Meerwasser) kultiviert, wenn es mit LEDs (730 nm, 20-30 W / m 2 ) mit dem Bicarbonatsalz (1 ) beleuchtet wurde g / l) als Quelle für anorganischen Kohlenstoff und Stickstoffgas (0,5 l / d) als Stickstoffquelle. Die Kultivierungszeit betrug 7 Tage ( 2a ).
Bild Nr. 2
Die größte Bestandteilseinheit, MaSp1- (6-mer), wurde für nachfolgende Experimente ausgewählt, da ein höheres Molekulargewicht von MaSp1 zu einer höheren Zugfestigkeit der Spinnenseidenfaser führen würde. Natriumbicarbonat wurde zur Lieferung von anorganischem Kohlenstoff verwendet, da Bicarbonatsalze eine höhere Löslichkeit und niedrigere Transportkosten als CO 2 -Gas aufweisen .
Frühere Forscher haben Experimente durchgeführt, um die erforderlichen Lichtbedingungen für das Wachstum von Zellen R. sulfidophilum zu bestimmen : Intensität (8 und 50 W / m 2 ) und Wellenlänge (730, 800 und 850 nm). Diese Studie untersuchte die Wachstumseffekte von rekombinantem R. sulfidophilummehrere zusätzliche Nährstoffe (Hefeextrakt, Vitamin, Eisen und Phosphor), denen ASW-Medien fehlen.
Die Trockenzellmasse (CDM) verringerte sich von 0,90 g / l (mit allen Nährstoffen) auf 0,66 g / l in Abwesenheit von Hefeextrakt und auf 0,39 g / l in Abwesenheit von Phosphor. Es wurde auch festgestellt, dass rekombinantes R. sulfidophilum in ASW-Medien ohne NaHCO 3 , N 2 -Gas oder Phosphor ( 2b ; ASW + N 2 , ASW + C + N 2 , ASW + C + P und ASW + P nicht wachsen kann + N 2 ).
CDM (~ 0,4 g / l) in solchen ASW- Mediumvarianten stammte höchstwahrscheinlich von Impfstoffen *oder Inokulum, selbst nachdem die Proben mit 2% Natriumchlorid gewaschen wurden. Daher sind Kohlenstoff-, Stickstoff- und Phosphorquellen für das Wachstum von rekombinantem R. sulfidophilum in ASW-Medium erforderlich .
Mikrobiologisches Impfmittel * - biologische Produkte, die lebende Kulturen von Mikroorganismen enthalten, die für Pflanzen nützlich sind.Wie erwartet stieg das Zellwachstum signifikant von 0,34 ± 0,02 g / l (ASW + C + N 2 ) auf 0,58 ± 0,08 g / l (1,7-fache Zunahme) und 0,81 ± 0,02 g / l (2,4-fache Zunahme). in Gegenwart von Hefeextrakt (ASW + C + N 2 + YE) bzw. Phosphor (ASW + C + N 2 + P).
Das höchste CDM wurde durch Zugabe von Hefeextrakt und Phosphor erreicht, was 1,04 ± 0,06 g / l ergab (eine 3,1-fache Zunahme).
Die Ausbeute von ~ 0,2 mg / l rekombinantem Protein MaSp1 (2% der Gesamtmenge an Proteinen) wurde unter den Bedingungen von ASW + N 2 , ASW + C + N 2 , ASW + C + P und ASW + P + N 2 ( 2c und 2d) beobachtet). Die Produktion des MaSp1-Proteins wurde durch die Zugabe eines Hefeextrakts unterstützt, der die Ausbeute des MaSp1-Proteins von 0,12 ± 0,10 mg / l (ASW + C + N 2 ) auf 3,93 ± 2,76 mg / l (ASW + C + YE + N 2 ) signifikant erhöhte .
Die Zugabe von Hefe erhöhte auch den Prozentsatz von MaSp1 in Gesamtproteinen von 1,2 ± 1,0 auf 6,9 ± 5,3%. Seltsamerweise beeinflusste die Zugabe von Phosphor, obwohl sie den Anstieg des CDM positiv beeinflusste, die Produktion des MaSp1-Proteins negativ.
Im Vergleich zu ASW + C + YE + N 2 im Medium ASW + C + YE + P + N 2 verringerte sich die Ausbeute des MaSp1-Proteins auf 2,71 ± 1,09 mg / l und der Prozentsatz von MaSp1 in den Gesamtproteinen verringerte sich auf 3,9 ± 1,6%.
Die Erklärung für diese Unterschiede in der Proteinproduktion in Abhängigkeit vom Kulturmedium kann in der Funktionalität jeder der Komponenten liegen. Beispielsweise ist Hefeextrakt in erster Linie eine Stickstoffquelle, die die Proteinbiosynthese fördert. Inzwischen ist Phosphor ein wichtiger Makronährstoff und Heteroelement in vielen wichtigen zellulären Verbindungen, was das Wachstum der Primärproduzenten fördert.
Um Spinnenseide in ihrer üblichen Form zu erhalten, musste MaSp1 gereinigt werden.
Bild Nr. 3
Um genügend MaSp1-Protein für die Faserextrusion zu erhalten, wurde eine Fermentation ( 3a ) durchgeführt, um MaSp1- (6-mer) herzustellen.
Im Allgemeinen korreliert die Größe der Spidroine positiv mit der Zugfestigkeit bis zu einem bestimmten Molekulargewicht. Größere Proteine haben mehr Interketten- und Intrachain-Wechselwirkungen, mehr Verwicklungen und weniger Endkettendefekte.
Die Reinigung von MaSp1- (6-mer) wurde unter Verwendung von Affinitätschromatographie durch einen Histidin-Tag, der am N-Terminus der MaSp1-Genkassette vorhanden war, und Gelfiltrationschromatographie durchgeführt. Als Ergebnis wurden ~ 10 mg gereinigtes MaSp1- (6-mer) ( 3b ) aus ~ 40 g CWM erhalten.
Seidenfasern wurden hergestellt, indem 10 Gew .-% gereinigtes MaSp1- (6 Maß), gelöst in Hexafluorisopropanol (HFIP), in ein Koagulationsbad pipettiert und anschließend manuell mit einer Pinzette ( 3c) gezogen wurden). Die besten Ergebnisse wurden unter Verwendung von 90% 2-Propanol als Koagulationsbad erzielt, was eine relativ sanfte Entwässerung verursachte, was ein effizientes Ziehen des Garns ermöglichte. Die Analyse mittels Rasterelektronenmikroskopie ergab, dass die Fasern einen Durchmesser von 10–20 µm haben und eine Oberfläche aufweisen, die parallel zur Faserachse mit Rillen bedeckt ist. Die Fraktographie zeigte, dass die innere Struktur aus Mikrofibrillen ( 3d und 3e ) bestand.
Um die Nuancen der Studie genauer kennenzulernen, empfehle ich Ihnen, den Bericht von Wissenschaftlern und zusätzliche Materialien zu lesen.
Epilog
In dieser Arbeit sprachen Wissenschaftler über die erfolgreiche Schaffung einer Mikrofabrik zur Herstellung des MaSp1-Proteins. Der Hauptführer dieser Produktion ist das Bakterium R. sulfidophilum , dank dessen es möglich war, eine photoheterotrophe Expression eines künstlichen Spinnennetzproteins unter Bedingungen eines photoautotrophen Wachstums zu erreichen.
Mit anderen Worten, Wissenschaftler haben das Bakterium genetisch verändert, um Spinnenseide zu produzieren, insbesondere das Protein MaSp1, das ein wichtiger Bestandteil davon ist. Neben genetischen Manipulationen mussten auch die optimalen Bedingungen für die Kultivierung der Bakterien festgelegt werden. Wie sich herausstellte, ist künstliches Meerwasser die ideale Umgebung. Zusätzlich war es notwendig, Stickstoffgas und Hefeextrakt als Nährstoffquellen zu verwenden. Zusammen führen diese Bestandteile zu einem effizienten Bakterienwachstum und damit zur Produktion von Spinnennetzprotein.
Es ist auch wichtig, dass die aus dem Protein gewonnenen Spinnennetzfasern in ihrer Struktur den natürlichen Spinnen sehr ähnlich sind, die von Spinnen der Nephila- Spezies produziert werden .
Die Wissenschaftler stellen fest, dass ihre Methode zum Anbau von Spinnenseidenprotein auch zum Anbau anderer Substanzen verwendet werden kann. In Zukunft planen die Autoren der Studie, ihre Mikrofabrik zu verbessern, um das Volumen der Proteinproduktion zu erhöhen und die molekularen Eigenschaften des resultierenden Produkts zu verbessern.
Laut Wissenschaftlern kann ihre Arbeit zur Lösung vieler Probleme beitragen: Energie-, Wasser- und Lebensmittelkrisen, Probleme mit festen Abfällen, globale Erwärmung usw. Der Grund für diese vielfältigen Möglichkeiten ist die Tatsache, dass Fabriken wie diese biologisch abbaubare und biokompatible Materialien in einem klimaneutralen Verfahren herstellen.
Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit, bleiben Sie neugierig und haben Sie eine gute Arbeitswoche, Jungs. :) :)
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