Die Temperatur ist einer der Hauptindikatoren für den Zustand des biologischen Systems. Wenn eine Person eine Infektion entwickelt, steigt ihre Körpertemperatur (normalerweise, aber nicht immer), was ein Zeichen für die Reaktion des Immunsystems auf die Bedrohung ist. Mit anderen Worten kann die Temperatur verwendet werden, um den ungefähren Zustand des Körpers zu bestimmen. Das Problem ist, dass eine Person groß ist (im wahrsten Sinne des Wortes), aber zum Beispiel sind Nematoden nur etwa 1 mm lang. Es war äußerst schwierig, die Temperatur eines so kleinen Organismus zu messen, aber Wissenschaftler der Universität Osaka (Japan) haben eine Methode entwickelt, um dieses Problem zu lösen. Mit welchen Mitteln wurde das Nanothermometer implementiert, welche praktischen Experimente haben gezeigt und wo kann diese Entwicklung eingesetzt werden? Antworten auf diese Fragen finden wir im Bericht der Wissenschaftler. Gehen.
Forschungsgrundlage
Die Körpertemperatur eines lebenden Organismus variiert in Abhängigkeit vom Grad des Einflusses interner und externer Faktoren. Wir sind daran gewöhnt, dass die Umgebungstemperatur die Temperatur kaltblütiger Menschen direkt beeinflusst, daher ändern sich ihre Werte mit beneidenswerter Regelmäßigkeit. Selbst bei warmblütigen Tieren werden unter normalen physiologischen Bedingungen Temperaturschwankungen beobachtet, die mit homöostatischer Thermoregulation und Energiestoffwechsel verbunden sein können.
Mit anderen Worten, der Witz ist hier großartig: "Ich spiele nicht herum, ich bin eine sehr beschäftigte Person auf zellularer Ebene." Durch genaue Messung der Temperatur und ihrer Dynamik im Submikronbereich können viele Informationen über die zelluläre und molekulare Aktivität erhalten werden. Das Problem ist, dass mit abnehmendem Messobjekt die Komplexität seines Verhaltens zunimmt (es ist schwierig, ein gewöhnliches Thermometer aus einer Apotheke in einen Nematoden zu stecken).
Die Autoren der Studie stellen fest, dass herkömmliche elektrische Thermometer keine Auflösung im Submikronbereich aufweisen und die Nahinfrarot-Thermografie normalerweise zur Bestimmung der Oberflächentemperatur biologischer Proben beiträgt, nicht jedoch der Innentemperatur.
Natürlich gibt es bereits lichtemittierende Nanothermometer (z. B. wärmeempfindliche molekulare Sonden), die diese Einschränkung überwinden können. Diese Technik hat aber auch Nachteile. Das wichtigste ist die Langzeitstabilität bzw. deren Abwesenheit. Solche Geräte können Temperaturänderungen, die lange dauern (z. B. einige Stunden), nicht genau messen. Ganz zu schweigen von der toxischen Wirkung eines solchen Thermometers auf die Probe.
In dieser Arbeit beschreiben die Wissenschaftler das Konzept eines Quantenthermometers mit Nanodiamant (ND aus Nanodiamant ), das hochgenau, robust und wenig toxisch ist. Das Funktionsprinzip lautet wie folgt: Der Sensor liest die Temperatur als Frequenzverschiebung der optisch nachweisbaren Magnetresonanz (ODMR aus)optisch detektierte Magnetresonanz ) defekter Zentren von Stickstoffleerstellen (NV aus Stickstoffleerstellen ), die hauptsächlich aufgrund der Wärmeausdehnung des Gitters entstehen. Der NV-Sensorkern ist tief in das Diamantgitter eingebettet und gegen verschiedene biologische Umweltfaktoren immun. Die Einführung dieses Quantensensors in komplexere Organismen ermöglicht es, ihre thermische Aktivität an einem bestimmten Ort in Echtzeit abzulesen. Der Prozess der Implementierung einer solchen Technik ist jedoch mit einer Reihe von Schwierigkeiten verbunden.
Nematoda (Spulwurm) der Art Caenorhabditis elegans .
Mehrzellige Modellorganismen wie Caenorhabditis elegans- Würmerbenötigen eine spezielle Kammer, die einen millimetergroßen Körper aufnehmen kann, und die Proben selbst müssen schnell analysiert werden, um ihren physiologischen Zustand aufrechtzuerhalten. Quanten-ND-Thermometer bewegen sich viel schneller als in kultivierten Zellen, selbst wenn der Körper dehydriert ist, was einen schnellen Partikelverfolgungsalgorithmus erfordert. Darüber hinaus verursachen die Positionsbewegung des ND und die komplexe Struktur des Körpers signifikante Schwankungen der detektierten Fluoreszenzintensität, was wahrscheinlich zu Artefakten bei der Temperaturmessung führt. Die Lösung dieser Probleme in dieser Phase der Studie ist mit der Anpassung des Geräts an die individuellen Eigenschaften der analysierten Probe verbunden. Das Problem der Vielseitigkeit und Leichtigkeit bei der Einrichtung des zukünftigen Nanothermometers soll in zukünftigen Arbeiten berücksichtigt werden.In der Zwischenzeit wurde auf das Konzept selbst und die Grundprinzipien der Arbeit geachtet.
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Die Basis des Nanothermometers ist ein konfokales Fluoreszenzmikroskop, das mit einer Mikrowellenbestrahlungseinheit (1A) ausgestattet ist.
Bild Nr. 1 Die
Stickstoffleerstellen-ODMR kann als Abnahme der Intensität der laserinduzierten Fluoreszenz gemessen werden, wenn eine spinresonante Mikrowellenanregung angewendet wird, da die Spinanregung den nicht fluoreszierenden Relaxationsweg vom angeregten Zustand in den Grundzustand aktiviert ( 1B ).
Die Probenkammer ist eine in die Antenne integrierte Einweg-Glasbodenschale, die einen großen optischen Zugang (12 mm Durchmesser) und eine einfache Bedienung ( 1C ) bietet und für empfindliche Proben wie Stammzellen geeignet ist. Zeit von der Erfassung des WurmsCaenorhabditis elegans ist nur 15 Minuten vor der eigentlichen Messung. Dies hilft, den Wurm am Leben zu erhalten und liefert mehr Daten über seine Gesundheit.
Darüber hinaus integriert das System effektiv eine schnelle Partikelverfolgung und eine hochpräzise Echtzeit-Temperaturschätzung aus dem NV-Center-Offset-ODMR.
Bei der Partikelverfolgung misst das System die ND-Fluoreszenzintensität entlang der xyz-Achsen des Mikroskops und konzentriert sich alle 4 Sekunden auf die entsprechende maximale Fluoreszenz (kürzeres Verfolgungsintervall ist möglich), wobei die Temperatur mit einer Abtastzeit von 0,5 bis 1,0 Sekunden geschätzt wird. ( 2A ).
Bild Nr. 2
Es gibt verschiedene Methoden der Quantenthermometrie, aber in dieser Arbeit wurde die ODMR-Vierpunktmessmethode verwendet. Bei dieser Methode wird davon ausgegangen, dass die Anzahl der bei allen vier ausgewählten Frequenzen detektierten Photonen entsprechend den Änderungen der detektierten Fluoreszenzintensität linear skaliert wird.
Es wurde jedoch gefunden, dass jedes nachfolgende Photon einen Unterschied in der Lichtempfindlichkeit von ungefähr 0,5% zeigt, was tatsächlich signifikante Artefakte bei der Schätzung der Frequenzverschiebung (d. H. 300 kHz, was mehreren Grad Celsius entspricht) erzeugt, insbesondere im Niedrigphotonenmodus.
Diese Artefakte sind höchstwahrscheinlich auf eine von der optischen Leistung abhängige Asymmetrie im ODMR-Spektrum zurückzuführen. Um die Temperatur komplexer optischer dynamischer Systeme (d. H. Biologischer Systeme) genau zu messen, ist es notwendig, solche Artefakte zu beseitigen. Daher wurde der Vierpunktmessmethode ein Fehlerkorrekturfilter hinzugefügt.
Um den Betrieb des Systems in Verbindung mit einer Fehlerkorrektur zu bewerten, wurden Echtzeitmessungen der Temperatur ND während schrittweiser thermischer Ereignisse durchgeführt. Plötzliche Temperaturänderungen konnten nicht verwendet werden, da plötzliche Temperaturänderungen eine starke Defokussierung der Brennpunkte und damit verbundene Schwankungen der Fluoreszenzintensität verursachen.
Bei 2B sind die Zeitprofile der Gesamtzahl der Photonen (I tot) und Temperaturschätzung ND (∆T NV ), wenn sich die Probentemperatur (T S ) von 44,3 ° → 30,4 ° → 44,3 ° mit einem Schritt von ∼2,8 ° ändert. Das System gibt ∆T NV entsprechend T S genau aus , während sich die Fokusposition insbesondere entlang der z-Achse über eine Entfernung von mehr als 30 μm ( 2C ) erheblich bewegt hat .
Bei einem 3 ° -Schritt tritt innerhalb von 3-4 Minuten eine Positionsverschiebung von 6 μm in der z-Achse auf, aber die Verfolgungsgeschwindigkeit ist hoch genug, um 96 Minuten lang der Dynamik von 105 nm / s zu folgen ( 2C ).
Darüber hinaus zeigt ∆T NV eindeutig eine Antikorrelation mit I tot... Eine statistische Untersuchung dieser Art von Temperaturabhängigkeit bestimmt die Durchschnittswerte für SD: I tot -1 dI tot / dT = -3,9 ± 0,7% / ° und dD / dT = - 65,4 ± 5,5 kHz / ° ( 2D ). Die Temperaturmessgenauigkeit beträgt ± 0,29 ° bzw. <0,6 ° C, was eine Empfindlichkeit von 1,8 ° C / √Hz ergibt.
Nachdem im Rahmen der Entwicklungsphase eine zuverlässige und genaue Echtzeit-Thermometrie erreicht worden war, wurde eine lokale Temperaturüberwachung an lebenden Würmern durchgeführt.
Bild №3
Bild 3A zeigt ND-anästhesierte Würmer im Inneren, die in der Nähe einer Mikrowellenantenne platziert sind. Diese NDs sind aufgrund der Oberflächenfunktionalisierung von Polyglycerin (PG ausPolyglycerin ) und werden durch Mikroinjektion in die Gonaden (Gonaden des experimentellen Wurms) eingeführt.
Grafik 3B zeigt das ODMR-Spektrum einer einzelnen ND (markiert mit einem Pfeil bei 3A ). 3C zeigt die Zeitprofile von I tot und ∆T NV über einen Zeitraum von 1 Stunde, wenn sich die Temperatur T S ändert .
Zunächst wurde T obj bei 33,2 ° C gemessen , nach 6 Minuten wurde eine Abnahme auf 25,3 ° C durchgeführt. Infolgedessen erreichte Tobj nach 35,2 Minuten 28,6 ° C. ∆T NV zeigte eine genaue Temperaturänderung zwischen zwei stationären Zuständen: 33,2 und 28,6 ° C.
Die Anzeige der tatsächlichen Temperaturdynamik innerhalb der Würmer zwischen diesen beiden stationären Zuständen wird angezeigt, da ∆T NV immer hinter T S zurückbleibt und aufgrund der endlichen Wärmekapazität des Mikroskopobjektivs und der Umgebung eine leicht unterschätzte Reaktion zeigt. I tot zeigt auch die allmählichen Änderungen der Fluoreszenzintensität, die durch die Temperatur verursacht werden.
Die Partikelverfolgung war ebenfalls zufriedenstellend ( 3C ). Innerhalb von 0-15 Minuten zeigen die gezählten Photonen häufige Bursts aufgrund von Positionsschwankungen der ND bei ungefähr 400 nm für einige Sekunden.
Die Testergebnisse zeigen deutlich die hohe Genauigkeit der Temperaturmessung im nanoskaligen biologischen System in Echtzeit. Ferner wurde beschlossen, zusätzliche Tests durchzuführen, vor denen die experimentellen Würmer einer pharmakologischen Behandlung mit C 10 H 5 F 3 N 4 O (FCCP aus Carbonylcyanid-4- (trifluormethoxy) phenylhydrazon ) unterzogen wurden , was zu einer unbeweglichen Thermogenese führte (grob gesagt zu einem Temperaturanstieg aufgrund eines Anstiegs) Stoffwechsel und ohne zusätzliche Muskelaktivität).
Bild №4
Bild 4A zeigt durch FCCP stimulierte ND-Würmer. Und Diagramm 4B zeigt das Zeitprofil von ∆T NVND in den Bildern mit einem Pfeil markiert.
In der siebten Minute nach Beginn der Messung wurde die FCCP-Lösung verwendet. In der 32. Minute beginnt ∆T NV allmählich anzusteigen, und in der 48. Minute wird ein noch größerer zusätzlicher Anstieg beobachtet, wenn der Grad der Temperaturänderung von 4 auf 7 ° C ansteigt. Das Fieber dauerte etwa 80 Minuten.
Während der Stimulation werden NDs langsam über eine Stunde um einige Mikrometer bewegt, was die Ergebnisse separater Experimente bestätigt, bei denen NDs kontinuierlich unter einem Mikroskop beobachtet wurden.
Die Kontrollgruppe der Würmer ( 4C und 4D ), denen kein FCCP injiziert worden war, zeigte während des gesamten Tests eine gleichmäßige ∆T NV- Reaktion ohne offensichtliche Temperaturänderungen.
Um weiter zu bestätigen, dass FCCP tatsächlich einen Anstieg der Körpertemperatur bei Würmern induziert, wurde die Quantifizierung von ND-markierten Würmern sowohl in Kontroll- als auch in Versuchsgruppen durchgeführt ( 4E ). Die Grafik zeigt deutlich einen Temperaturanstieg der Würmer aus der Versuchsgruppe im Vergleich zur Kontrolle.
Ein weiteres Kontrollexperiment, bei dem kein Puffer zugesetzt wurde und die ∆T NV statisch überwacht wurde, zeigt, dass die Zugabe des Dotierstoffs dazu führt, dass die ∆T NV aufgrund von Temperaturänderungen oder aufgrund von ODMR-Verschiebungsartefakten auf einem bestimmten Niveau schwankt . Die Beobachtung einer solchen Verschiebung ist jedoch mit der Zugabe von FCCP unmöglich, was zusätzlich den Temperaturanstieg aufgrund von FCCP in der Versuchsgruppe der Würmer ( 4F) bestätigt).
Um die Nuancen der Studie genauer kennenzulernen, empfehle ich Ihnen, den Bericht von Wissenschaftlern und zusätzliche Materialien zu lesen.
Epilog
In dieser Studie konnten Wissenschaftler eine Methode entwickeln, mit der Sie die Temperatur in einem nanoskaligen biologischen System in Echtzeit genau messen können. Übertrieben gelang es ihnen, die Körpertemperatur des Wurms Caenorhabditis elegans zu messen , der ungefähr 1 mm lang ist.
Es ist wichtig zu verstehen, dass es viel einfacher ist, etwas in einer großen Probe zu messen als in einer kleinen. Die Verwendung von Nanodiamanten, die in den Körper der Würmer injiziert wurden, ermöglichte es jedoch, die Körpertemperatur des Wurms unter normalen Bedingungen herauszufinden. Diese Nanodiamanten, die in den Körper gelangen, beginnen sich schnell zu bewegen. Ein speziell entwickelter Algorithmus und ein konfokales Fluoreszenzmikroskop ermöglichten die Verfolgung und Analyse ihrer Bewegung. Die erhaltenen Daten ermöglichten es, die Körpertemperatur des Wurms und seine Dynamik auch nach Einführung einer speziellen Substanz, die einen Temperaturanstieg verursachte, genau zu bestimmen.
Diese Arbeit zeigt nicht nur, dass Quantentechnologien in der Biologie angewendet werden können und sollten, sondern erweitert auch die Möglichkeiten im Hinblick auf die Diagnose verschiedener Prozesse auf Makroebene. Sehr oft hängt der Zustand eines biologischen Systems direkt oder indirekt von den Prozessen in Zellen ab, die zuvor in Echtzeit äußerst schwierig zu messen waren. Wenn Sie mehr Informationen zu den Bestandteilen des Systems erhalten haben, können Sie das System selbst besser verstehen, wodurch Sie natürlich dessen Betrieb effektiver beeinflussen können.
Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit, bleiben Sie neugierig und haben Sie ein schönes Wochenende, Jungs! :) :)
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