Wenn Sie sich für Biologie interessieren, insbesondere wenn Sie dieses Fach unterrichten, ist mein Artikel über die Vorbereitung und Durchführung von Laborarbeiten zur Identifizierung eines genetisch fremden Gens in der DNA von Lebensmitteln für Sie hilfreich.
Die Kontroverse um GVO sowie die unaufhörlichen wissenschaftlichen und ethischen Diskussionen über die Rechtmäßigkeit menschlicher Eingriffe in die "Angelegenheiten der Natur / Gottes" werden den Philosophen überlassen. Wir stellen nur fest, dass die Fachkompetenz eines modernen Biologen, Biotechnologen, Bioinformatikers und Genetikers ohne die Fähigkeit, Gene zu erforschen und gegebenenfalls zu verändern, nicht denkbar ist. Bereits in der Schule und später an der Universität erfordern biotechnologische Experimente und Experimente, dass Schüler und Studenten klare Aufgaben stellen, die Methodik des Experiments verstehen und Daten analysieren können. All dies entwickelt Neugier und Selbstvertrauen und schafft eine Grundlage für die weitere Erforschung von Fragen und Problemen im Zusammenhang mit wissenschaftlicher Forschung. Mein PLAN-KONSPEKTbasierend auf 3 Tests, die mit BioRad-Reagenzien und Standardgeräten durchgeführt wurden, die für PCR-Analysen erforderlich sind. Natürlich können auch andere KITs zum Nachweis von GVO verwendet werden. Alle Nuancen des Experiments (Protokolle) sind in der Dokumentation zu den Reagenzien ausführlich beschrieben, daher werde ich nicht näher darauf eingehen. Der Umrissplan trägt also zwei Namen: PLAN - weil es erforderlich ist, den Inhalt des Unterrichts klar und genau zu planen, und CONSPECT - weil es notwendig ist, im Voraus zu überlegen , welches Material die Kinder unterrichten sollen und worauf sie sich konzentrieren sollen, um den Zweck des Experiments vollständig aufzudecken.
Planen
Die Erfahrung ist für zwei Sitzungen ausgelegt.
Lektion eins:
1. Theoretische Einarbeitung der Schüler in die Grundlagen der Strategie zur Erkennung von GVO (Ziele zur Erkennung und Identifizierung).
2. Isolierung von DNA aus Lebensmitteln (ein Schüler oder Schüler bringt ein Produkt seiner Wahl mit).
3. Durchführung der Polymerasekettenreaktion.
Zweite Lektion:
4. Gelelektrophorese und Diskussion.
5. Abschließende Bemerkungen des Lehrers.
Abstrakt
Erste Stunde
1. Woher kommen neue Gene und Hilfselemente (15-20 Minuten)
? Gentechnisch veränderte Organismen sind Organismen, die eine fremde Kombination von genetischem Material aufweisen, das mit moderner Biotechnologie gewonnen wurde. Beispielsweise können bei Verwendung von Ti-Plasmiden Fremdgene und Eigenschaften genetisch veränderter Pflanzen Gene sein, die Resistenz gegen Herbizide (cp4, epsps, gox), Resistenz gegen Schädlinge (cry) oder Gene, die die Produktqualität verändern (PG, Bay TE). Für die Expression eines Fremdgens in einer Wirtszelle sind zusätzliche genetische Elemente erforderlich:
- Promotor - eine Nukleotidsequenz, die von der RNA-Polymerase als Marker für die Transkriptionsinitiierung erkannt wird;
- – , - ;
- - – ( ), ;
- – , , .
Das Plasmidkonstrukt enthält auch ein hochkonserviertes Chloroplastengen aus Photosystem II - Teil der Lichtreaktion der Photosynthese, um zu bestätigen, dass lebensfähige DNA extrahiert wurde und dass ein negatives GM-Ergebnis nicht mit einer nicht lebensfähigen Matrix assoziiert ist.
Die Identifizierung von rekombinanter DNA in Lebensmitteln kann auf verschiedene Arten erfolgen, wie in Abbildung 1 gezeigt.
Abbildung 1. Identifizierung von rekombinanter DNA in Lebensmitteln
Die gebräuchlichsten gebrauchsfertigen Reagenzienkits zur Identifizierung von GVO-Produkten basieren auf der Identifizierung eines Promotors und Terminators. Das GMO Investigator Kit von BioRad verwendet PCR und DNA-Elektrophorese, um das Vorhandensein von zwei verschiedenen DNA-Sequenzen zu überprüfen, die mit GVO assoziiert sind: dem 35S-Promotor aus dem Blumenkohlmosaikvirus und dem Nopalinsynthase-Gen-Terminator aus Agrobacterium tumefaciens. Diese DNA-Sequenzen kommen in> 85% der weltweit vermarkteten gentechnisch veränderten Pflanzen vor. Das neue Gen in der DNA der Positivkontrolle ist epsps. Als Kontrolle der Integrität der aus Lebensmitteln extrahierten Pflanzen-DNA wird die PCR verwendet, um einen Teil des Photoplasten-II-Chloroplasten-Gens zu amplifizieren, der den meisten höheren Pflanzen gemeinsam ist. Der Test zielt also auf 3 Ziele ab: einen Promotor,Terminator und Teil des Chloroplasten-Gens des Photosystems II in einem Satz von 3 Primern, von denen zwei (Primer des Promotors und des Terminators) gemischt wurden. Daher enthält das Set 2 Flaschen: Rot-GVO-Primer, mit denen bestimmt wird, ob das Lebensmittel GVO enthält, und Grünpflanzen-Photosystem II, mit dem festgestellt wird, ob DNA aus Pflanzenmaterial extrahiert wurde.
Nach der Einführungsrede sollten die Schüler mit dem Protokoll für DNA-Extraktion und PCR vertraut gemacht werden, Schritt für Schritt den Verlauf des Experiments erläutern und sich auf die Merkmale der Arbeit mit einem KIT eines bestimmten Herstellers konzentrieren.
2. Isolierung von DNA aus Lebensmitteln (15-20 Minuten)
Abhängig von den verfügbaren Arbeitsplätzen können Kinder in Gruppen von 2-3 Personen eingeteilt werden, von denen jede ein Lebensmittelprodukt zur Analyse auswählt. Chips oder Popcorn, die von Schulkindern so geliebt werden, sind als Forschungsmaterial willkommen, da fast alle Kartoffeln und Mais, aus denen knusprige Leckereien hergestellt werden, fremde Gene enthalten und es sehr einfach ist, GVO in ihnen zu identifizieren. Oder Beeren, zum Beispiel Erdbeeren, Blaubeeren, Brot mit Sonnenblumenkernen. Es ist jedoch ratsam, im Voraus zu vereinbaren, wer welches Produkt testen wird, da KITs für die DNA-Extraktion für bestimmte Produkte entwickelt wurden und beispielsweise die in diesem Fall verwendete KIT nicht die Isolierung von DNA aus Mehl, Öl, Gewürzen, Cornflakes usw. impliziert.
In den von mir beschriebenen Experimenten wurde DNA aus Blaubeeren, Gurken und Sonnenblumenkernen isoliert.
Besonderheiten dieser Studie:
- Vorwiegen der Probe (1 g) und gründliches Mahlen mit einem Mörser. Mahlen ist notwendig, um die ziemlich dichten Zellwände von Pflanzen zu zerstören (die tierische Zellen nicht haben).
- Isolierung mit einer homogenisierten InstaGene-Matrix (obwohl natürlich ein Detergens verwendet werden kann) ohne Zugabe von Proteasen (Zerstörung von zellulären Proteinen) und ohne Ausfällung von DNA mit Salzen, da sich das Salz bereits in InstaGene befindet.
- Es gibt kein Sorptionsmittel im KIT, daher können Kinder ohne Elution im Prinzip nicht darauf achten.
Warum wurde InstaGene Matrix grundsätzlich verwendet? Weil dies ein ziemlich schneller Weg ist, um DNA zu isolieren - innerhalb von 15 bis 20 Minuten, was die Unterrichtszeit erheblich spart. InstaGene chelatiert auch zweiwertige Ionen (z. B. Mg2), die für Enzyme erforderlich sind, die DNA zerstören (z. B. DNase).
3. Durchführung der Polymerasekettenreaktion
Nach der erfolgreichen Isolierung von DNA aus Lebensmitteln durch Kinder gemäß den Protokollen des Herstellers werden PCR-Gemische für 6 Eppendorf-Röhrchen gemäß Tabelle 1 (10-15 Minuten) hergestellt.
Link
Danach endet der 1. Teil des Experiments. Der Lehrer legt die Röhren selbst in den Verstärker und stellt die Verstärkungsmodi gemäß dem Protokoll ein.
Zweite Lektion
4. Gelelektrophorese und Diskussion (40-45 Minuten)
Kinder bereiten ein 3% iges Agarosegel in TAE-Puffer vor. Während die Elektrophorese dauert (200 V 20 Minuten), können Sie die wahrscheinlichen Optionen für die Ergebnisse diskutieren (Abbildung 2). Besprechen Sie nach Erhalt der Fotos mögliche Fehler.
Abbildung 2. Mögliche Testergebnisse
Referenz
Beispielsweise wurden in der Gruppe der Kinder, die Gurken testeten, keine Amplikons beobachtet (Abbildung 3).
Abbildung 3.
Gelbild der Probenelektrophorese (Gurke) ⁕ - Kontrollen (- ohne GVO, + ohne GVO); T - Testprobe; M - Molekulargewichtsmarker; PMM - Photosystem II Primer; GVO ist eine Grundierung für GVO.
Diskussion über die Ergebnisse von 1 Probe:In diesem Fall wurden dem Amplifikationsgemisch keine Primer zugesetzt.
Die zweite Erfahrung ist das Testen der DNA von Sonnenblumenkernen (Abbildung 4).
Abbildung 4.
Gelbild der Elektrophorese, Sonnenblumenkernprobe ⁕ - Kontrollen (- enthält kein GVO, + enthält GVO); T - Testprobe; M - Molekulargewichtsmarker; PMM - Photosystem II Primer; GVO ist eine Grundierung für GVO.
Diskussion über die Ergebnisse der 2. Stichprobe:Die Negativkontrolle (Geltasche 2), in deren Genom keine modifizierten Gene vorhanden waren, enthält keine Amplikons. Dies zeigt an, dass der Primer die Sequenzierungsregion des 35S-Promotors und des NOS-Terminators nicht erkannte. Das entgegengesetzte Muster mit dem Nachweis eines Amplikons von etwa 200 Basenpaaren wurde in der 6. Geltasche beobachtet (Positivkontrolle - genetisch veränderte Kontrolle). Visuell wurde im Positivkontroll-GVO (Geltasche 6) nur ein Amplifikationsprodukt mit einer Länge von etwa 200 bp erhalten, aber die Amplifikationsprodukte des Promotors und des Terminators waren nahezu gleich groß (203 bp bzw. 225 bp (BioRad)) dass wir davon ausgehen können, dass sich zwei Amplifikationsprodukte in der Tasche von Gel 6 befinden.In den meisten Studien werden der 35S-Promotor und der NOS-Terminator am häufigsten verwendet und können in mehr als 85% der Fälle zum Nachweis modifizierter Gene verwendet werden. Diese Methode reicht aus, um die Frage zu beantworten, ob der obige Promotor und / oder Terminator vorhanden war, aber diese Methode reicht nicht aus, um zu beantworten, welche Gene inseriert wurden.
Amplikons, die für das Photosystem II-Chloroplastengen spezifisch sind, können in allen 3 Lebensmittelproben (Taschen 1, 3, 5) gefunden werden, sowohl solche, die modifizierte Gene enthalten, als auch solche, die keine modifizierten Gene enthalten. Die untersuchten Proben enthielten keine Amplikons des NOS-Terminators oder des 35S-Promotors (Tasche 4). Trotz der Tatsache, dass das Experiment erfolgreich durchgeführt wurde und die Schüler ein eindeutiges Ergebnis erhielten, ist das Foto nicht ganz klar, als ob es bewölkt wäre. Da sich dieses Phänomen auf das gesamte Gel erstreckte, kann geschlossen werden, dass während der Herstellung von 1 × TAE-Puffer eine Kontamination auftrat. Es war wahrscheinlich kontaminiertes Glas im Labor.
Die neueste Erfahrung ist das Testen von Blaubeeren (Abbildung 5).
Abbildung 5. Gelbildelektrophorese der Blaubeerprobe
⁕ - Kontrollen (- enthält kein GVO, + enthält GVO); T - Testprobe; M - Molekulargewichtsmarker; PMM - Photosystem II Primer; GVO ist eine Grundierung für GVO.
Diskussion über die Ergebnisse von 3 Proben: Nach dem Laufenlassen des Gels wird das Agarosegel von oben nach unten betrachtet. Alle 3 Lebensmittelproben enthalten Amplikons, die für das Photosystem II-Chloroplastengen charakteristisch sind. In der Negativkontrolle (mit GVO-Primern) ist eine Bande zu sehen, da dies eine genetisch freie Kontrolle ist, ist dies sehr seltsam. Es wurden keine Amplikons von etwa 200 Basenpaaren erwartet. Band von 200 bp erscheint auch in der Testprobe (Blaubeere) und in der Positivkontrolle. Dies zeigt an, dass der Primer die Sequenzierungsstelle des 35S-Promotors des NOS-Terminators erkannte.
Warum sich der Test einer Blaubeerprobe als positiv (gentechnisch verändert) herausstellte, kann daran liegen, dass Blaubeeren eine natürliche transgene Pflanzenart sind.
Die untersuchte Probe ist wahrscheinlich ein Beispiel für die Interferenz eines Organismus mit einem anderen Organismus unter Verwendung von Bodenbakterien (Tumefaciens). Ein solches Beispiel für einen natürlichen transgenen Transfer in Blaubeeren wurde bereits von Tatyana Matveeva, Doktorin der Biowissenschaften, Professorin am Institut für Genetik und Biotechnologie der Fakultät für Biologie der Staatlichen Universität St. Petersburg, identifiziert. Sie und ihre Kollegen am Institut haben einen weltweiten Katalog von Pflanzen mit bereits sequenzierten Genomen zusammengestellt. Von den 275 untersuchten Pflanzenarten waren 23 natürliche Transgene. Enthält Erdnusssorte, Walnusssorte, Hopfen, tropische Guavenfrüchte, Nelkenblüten, surinamische Kirschen, Preiselbeeren und Blaubeeren. (Matveeva, 2019).
Daher wird angenommen, dass die untersuchte Blaubeere ein natürliches Transgen ist.
5. 2
Es scheint, dass die Durchführung einer PCR einfach ist, aber die Fehlerbehebung kann schwieriger sein, wenn das gewünschte Amplikon nicht erhalten wird oder wenn unspezifische Fragmente auftreten. Am häufigsten sprechen wir im Labor über kontaminierte Glaswaren. Um eine Kontamination der Reagenzien und PCR-Ansätze zu vermeiden, muss darauf geachtet werden, für jeden Pipettiervorgang frische Pipettenspitzen zu verwenden. Darüber hinaus ist es sinnvoll, die Handschuhe während der Arbeit häufiger zu wechseln. Darüber hinaus sollten immer neue und sterilisierte Reaktionsgefäße und -lösungen verwendet und ordnungsgemäß gekennzeichnet werden, um die Kontamination eindeutig zu verfolgen. Es kann viele Gründe geben, warum die PCR nicht funktioniert. Für eine erfolgreiche PCR müssen verschiedene chemische und physikalische Parameter beachtet werden. Leider kommt es sehr oft vor, dass nach der PCR nicht die gewünschten Ergebnisse erzielt werden können.
Da selbst kleinste DNA-Mengen durch PCR nachgewiesen werden können, ist es äußerst wichtig, eine Kontamination von PCR-Reaktionsmischungen mit PCR-Produkten aus früheren Experimenten oder "Fremd-DNA" aus anderen Quellen zu vermeiden.
Ergebnis
Die Erfahrung beim Nachweis von GVO in Lebensmitteln soll praktische Fähigkeiten bei der Durchführung der Polymerasekettenreaktion vermitteln. Trotz der Tatsache, dass ein Synopsenplan vorgeschlagen wird, der für zwei Lektionen ausgelegt ist und zwischen denen mindestens ein Tag liegt, liegt das typische Szenario im Ermessen des Lehrers. Die analytischen Abschnitte dieser Studie sollen die Lernenden durch den Prozess des Entdeckens und Verstehens von Konzepten führen, die für Verfahren und Datenanalyse in jeder Phase der Reise relevant sind. Es ist zu hoffen, dass dieser Ansatz (im Vergleich zu dem Lehrer, der den Schülern alle Hintergrundinformationen gibt) die gesamte Studie für eine größere Anzahl von Schülern verständlicher macht. Solange der Lehrer die Möglichkeit hat, den Fortschritt und das Verständnis jeder Gruppe zu überprüfen (während 2 Lektionen),Auf Wunsch ist ein gewisses Maß an Unabhängigkeit möglich. Dieser Ansatz ermöglicht es mehr Lernenden, die gewünschten Fähigkeiten wie oben definiert zu erwerben.
Liste der verwendeten Literatur:
- bio-rad, „www.bio-rad.com“, 3. Februar 2020. [Online]
- Matveeva T., Ottem L. (2019). Weit verbreitetes Auftreten der natürlichen genetischen Transformation von Pflanzen durch Agrobacterium. Plant Molecular Biology, 101, 415 & ndash; 437. DOI: 10.1007 / s11103-019-00913-y